分子检测使转移性NSCLC治疗发生了变革。研究显示，较罕见的突变主要发生于EGFR和BRAF基因，通常与非典型临床表现相关。本文描述了一例罕见病例，该病例为一名携带BRAF外显子15 p.K601E突变的肺癌患者，同时伴有腹膜转移。化疗联合免疫一线治疗后，PFS为8-9个月。BRAF和MEK抑制剂二线治疗后，出现了混合反应，表明这些抑制剂对此罕见突变仅有部分作用。 背 景 由于潜在的分子靶点越来越多，全面基因组测序（CGP）和免疫组化/免疫细胞化学（IHC/ICC）已经成为非小细胞肺癌（NSCLC）患者管理中不可或缺的方法。事实表明，在过去的十年中，由于携带常见致癌突变（EGFR和ALK）的患者从选择性酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）治疗中长期获益，生存预期有了很大的改善。另一方面，携带更多罕见突变的患者的预后仍然很差，这主要是由于靶向治疗的可及性低。BRAF就是这样一个致癌驱动基因。目前正在开发能够阻断BRAF信号通路的选择性BRAF抑制剂，有研究表明这种治疗策略能够延长一些患者的总生存期。 详细来说，BRAF参与激活MAPKs，包括RAS。在结构上由RAF激酶家族特有的三个保守结构域组成：保守区1（CR1），一个RAS-GTP结合的自我调节结构域；保守区2（CR2），富含丝氨酸的铰链区；保守区3（CR3），一种蛋白激酶催化结构域，使蛋白底物上的一致性序列磷酸化。子区域包括p环（残基464-471），在酶ATP结合、核苷酸结合袋（NBP）、催化环、激活环和DFG基序的过程中稳定ATP不可转移磷酸基团。所有这些在调节MAP激酶/ERK信号通路中发挥核心作用，从而影响细胞分裂、分化和分泌。在其活性构象中，BRAF通过其激酶结构域的氢键和静电相互作用形成二聚体。当BRAF发生突变时，RAS-RAF-MEK-ERK通路持续激活，最终导致细胞不受控制地生长和增殖。在1%至2%的肺腺癌中发现BRAF突变，BRAF突变常见于从不吸烟者、女性和侵袭性微小乳头状组织学类型中；也见于非霍奇金淋巴瘤、结直肠癌、恶性黑色素瘤、甲状腺乳头状癌、脑瘤以及一些炎症性疾病，如Erdheim-Chester病。 由于BRAF突变的分子结构极其复杂，开发靶向BRAF突变的药物具有挑战性。BRAF突变通常分为p.V600和非p.V600，根据外显子位点分为三类。NSCLC患者中约50%的BRAF突变为非p.V600。I类突变，即p.V600E/K/D/R突变，发生在15号外显子600号氨基酸的缬氨酸残基上。这些突变通过MAPK信号转导通路，导致BRAF激酶持续激活，从而对BRAF和MEK抑制剂表现出高结合力。II类突变，即p.K601、p.L597、p.G464和p.G469，位于激活段或p环内，并作为RAS非依赖性二聚体转导信号。因此，该类增加了固有激酶活性，阻断了与P环的相互作用，并保留了自抑制激酶状态。最后，III类突变通常在p环、催化环或DGF基序中发现，并对BRAF激酶活性有负面影响。事实上，与II类相比，III类BRAF 非V600突变的基底激酶活性比野生型BRAF低或没有。重要的是，有临床前研究表明，这些突变在RAS依赖性二聚体化过程中与CRAF或野生型BRAF作为异源二聚体转导信号，导致MAPK通路上游激活。由于所有II类和III类BRAF突变均为非p.V600，通常对当前的BRAF抑制剂不太敏感。 BRAF缺失和易位导致BRAF和MEK抑制剂耐药，使BRAF突变更加复杂。BRAF缺失通过抑制活性构象中的αC螺旋增强激酶活性，从而与I类突变作用类似。此外，BRAF激活融合，在不到1%的NSCLC病例中发现，发生在N端CR1自身抑制结构域的截断中，因此与II类突变作用类似。该结构域的缺失导致BRAF通路组成性激活。 有研究显示，BRAF外显子15 p.K601E突变NSCLC对药物不敏感。此突变属于II类突变，突变频率略高，发生在约5%的BRAF突变肺腺癌中。BRAF K601E突变导致赖氨酸被谷氨酸替换，从而被BRAF二聚体激活，降低了特定抑制剂的结合能力，包括达拉非尼和维莫非尼，增加了MEK和ERK信号通路的活性。有研究报告了患者从曲美替尼治疗中获益较小。该药物在BRAF外显子15 p.K601E突变的黑色素瘤患者中药理活性持久，但在BRAF外显子15 p.K601E突变的肺腺癌患者中药理活性仅持续几个月。 本文描述了一例罕见病例，该病例为一名BRAF外显子15 p.K601E突变NSCLC患者，临床表现非典型。一线化疗+免疫治疗获得缓解，二线靶向BRAF和MEK通路的联合治疗方案也获益。 2021年4月，一名有严重吸烟史的68岁男性到我院急诊科就诊。患者出现呼吸困难和咳嗽，在过去几个月里病情加重。SARS-CoV-2检测后，患者进行了紧急肺部CT扫描，显示双侧胸腔积液，左下叶有一个约57×45 mm的实性病灶，边缘有毛刺，伴有癌性淋巴管炎，右肺有多个实质性微小结节。此外，还显示气管旁、隆嵴前方和下方同侧、主动脉-肺淋巴结肿大，最大直径达25 mm（图1A-C）。其他身体部位没有发现病灶。患者接受了姑息性胸腔穿刺术引流了约1500mL血性胸腔积液，以及诊断性支气管镜检查。细胞学检查显示非典型上皮细胞，具有严重的核异常，排列在腺体结构中。ICC分析显示甲状腺转录因子1（TTF-1）呈阳性，钙视网膜蛋白和Wilms肿瘤蛋白（WT1）呈阴性。根据这些临床、影像学、形态学和ICC特征，患者被诊断为NSCLC，倾向于腺癌。 图1. 2021年4月。（A，B）CT扫描显示双侧胸腔积液，左下叶有一个约57×45 mm的实性病灶，边缘有毛刺，伴癌性淋巴管炎。（C） 胸部X线显示双侧胸腔积液，伴癌性淋巴管炎。（D） 腹部超声显示胸腔积液。 于是，患者到临床实验室进行了EGFR、ALK、ROS1、BRAF和KRAS分子检测，以及PD-L1表达检测。未发现可治疗的突变，PD-L1表达阴性（肿瘤比例评分（TPS）<1）。2021年6月，患者入院，开始接受第一个周期的卡铂+培美曲塞+帕博利珠单抗治疗。此外，体格检查发现有腹水，随后超声检查证实了这一点（图1D）。因此，立刻进行腹腔穿刺术，抽放了约5L黄色腹水。腹膜细胞学检查发现了TTF-1阳性恶性细胞，提示来源于肺癌的腹膜转移癌（PCM）。腹水中的癌胚抗原（CEA）水平高于500ng/mL。在临床实验室进行的细胞块分析显示BRAF外显子15 p.K601E非典型突变，PD-L1表达水平≥50%。由于BRAF外显子15 p.K601E突变的肺腺癌患者靶向治疗相关数据有限（图2和图3），我们首选化疗+免疫治疗而不是靶向治疗来控制症状。 图2. 分子检测。NGS显示存在BRAF外显子15 p.K601E点突变。 图3. BRAF蛋白3D展示 值得注意的是，四个周期后，腹水完全消退。同时，呼吸困难显著改善。家庭氧疗逐渐减少到3L/min，每天15min，仅在运动时使用。总体而言，患者的身体状况和食欲明显改善。临床上，右肺结节和原发病灶缩小。癌性淋巴管炎也减轻了（图4A，B）。然而，在2022年2月的门诊随访中，患者整体状况似乎有所恶化。患者主诉腹部沉重，腿部肿胀，呼吸困难加重，需要将氧疗增加到6L/min，每天持续数小时，即使在休息时也是如此。还发现疾病进展。经超声检查证实，重新出现腹水。此外，胸部X线显示双侧胸腔积液和癌性淋巴管炎恶化。于是，进行了胸腔穿刺术，引流了约2L血性液体。很明显，患者出现癌症复发。于是患者开始接受达拉非尼（300mg/天）+曲美替尼（2mg/天）二线治疗（图5A，B）。令人震惊的是，15天后，腹水不再明显，腿部肿胀消除。然而，呼吸困难没有得到缓解。由于需要全天持续氧疗（6L/min），患者接受了胸腔穿刺术。尽管如此，2022年4月，患者进入次重症监护室（图6），进行了胸腔引流。随后进行了姑息性无创通气，直到因心肺功能衰竭而死亡。 图4. 2021年9月。（A，B）CT扫描和X线显示双侧胸腔积液和癌性淋巴管炎缓解。 图5. 2022年2月。（A，B）胸部X线显示肺间质疾病急剧恶化，腹部超声显示胸腔积液。 图6. 2022年4月。无创通气期间弥漫性肺间质疾病和肺部进展。 讨 论 NSCLC中的BRAF p.V600和非p.V600突变与不同的临床和病理特征相关。前者在男性和女性吸烟者中的发病率大致相同，而后者在男性吸烟者中的发病率更高。尽管针对BRAF外显子15 p.V600E突变肺腺癌的联合治疗疗效已知，但这些治疗方案在携带II类和III类BRAF突变患者中的临床获益尚不明确。原因是携带这些突变的人群比携带I类突变的人群更加复杂，数量更少，因此在II-III期试验中更难分析。一些有见地的研究试图阐明晚期NSCLC中这些罕见突变的侵袭性行为。例如，几年前的一项研究表明，I类突变的侵袭性可能低于非p.V600突变，非p.V600突变更可能出现在脑转移患者中，和RAS突变同时出现。该研究表明，BRAF非p.V600突变患者无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）较短。该研究还表明，生存率的差异可能是由于I类患者胸外转移较少，且更常接受靶向治疗。最近的一项研究显示，与非吸烟者相比，吸烟者非p.V600突变频率更高，而且，有趣的是，吸烟状态与免疫治疗疗效更好相关。最近，进一步研究表明，由于II类和III类BRAF突变与KRAS突变同时出现，而KRAS突变与PD-L1表达水平较高相关，因此II类和III类BRAF突变对免疫检查点抑制剂（ICI）比I类突变更敏感。 一些研究描述了BRAF外显子15 p.K601E突变逃避免疫检查点的潜在分子机制。BRAF外显子15 p.K601E突变发生在约0.2%的NSCLC病例中，影响激酶结构域中的激活片段，从而通过阻碍与磷酸结合环（p环）的结合，降低激酶自抑制。显然，这种构象增加了体外激酶活性和下游MEK磷酸化。此外，p.K601E突变作为二聚体转导信号，从而阻止BRAF抑制剂与单体激酶结构域结合。最近的研究显示，12例携带BRAF外显子15 p.K601E驱动突变的患者，包括3例NSCLC和9例黑色素瘤患者，对选择性BRAF抑制剂单药治疗没有反应。另一项研究表明，p.K601E突变黑色素瘤患者从MEK抑制剂曲美替尼治疗中持续获益，而p.K601E突变肺腺癌患者仅获得短期缓解（4个月）。另一方面，研究表明，BRAF和MEK抑制剂联合治疗，如达拉非尼和曲美替尼，可以有效地抑制下游信号转导。 在一项多中心欧洲BRAF队列（EURAF）回顾性研究中，6名携带非p.V600E突变的患者接受了特定的靶向治疗，其中5名患者中位总生存期为11.8个月，而I类突变患者为25.3个月，很可能是因为对BRAF抑制剂耐药。 据报道，中国患者携带BRAF突变的比例更低，约0.5-2%的NSCLC病例携带BRAF突变。在一项关于携带BRAF突变的中国NSCLC患者的多中心回顾性研究中，Mu等人发现11名携带非p.V600E突变的患者，包括4名BRAF外显子15 p.K601E突变肺腺癌患者。研究评估了几种抗癌药物的临床疗效。总的来说，就PFS而言，疗效令人失望。一名患者对铂类化疗一线治疗反应不佳，在接受达拉非尼+曲美替尼二线治疗后出现疾病进展（PD）。另外两名患者在抗BRAF一线靶向治疗后，PFS分别为2.0个月和4.0个月。剩下一名患者在纳武利尤单抗+化疗二线治疗后，PFS为3.5个月。考虑到高加索人和亚洲人遗传背景的差异，我们认为研究亚洲NSCLC患者的BRAF突变可能对分析这些突变复杂的分子特征有重要意义。 尽管先前的小样本回顾性研究表明了PD-L1表达与BRAF突变NSCLC患者之间的相关性，但BRAF突变肺腺癌患者经抗PD-(L)1单药治疗客观缓解率仅为10-30%，中位PFS为2-4个月。关于野生型NSCLC接受免疫检查点抑制剂（ICI）单药二线治疗的研究显示了类似的结果，接受ICI单药治疗的V600E和非V600E突变NSCLC的PFS没有差异。而最近的一项病例报道显示，BRAF外显子15 p.V600E突变肺癌患者持续获益于ICI+化疗一线治疗，PFS约为20个月。基于这些结果，评估化疗+免疫联合治疗BRAF外显子15 p.K601E阳性NSCLC的疗效具有意义。 本病例报道是有意义的，原因有几个。首先，本病例临床表现非典型，腹膜转移（MPC）在NSCLC中较为罕见，往往提示存在潜在可靶向治疗的突变。先前的研究表明，MPC NSCLC大部分是腺癌，通常携带EGFR突变或ALK重排。值得注意的是，肿瘤组织样本检出EGFR突变的患者，约60%腹水细胞学检查可以成功检出此突变。驱动基因突变阳性/阴性患者OS分别为12.0个月和2.5个月，靶向治疗显著改善预后。尽管目前仍没有关于BRAF突变NSCLC的MPC数据。第二，本文患者携带BRAF外显子15 p.K601E非典型突变，目前还没有关于化疗联合免疫一线治疗此类患者疗效的临床经验。此外，关于这种罕见突变对靶向治疗敏感性的研究报告了不一致的结果。帕博利珠单抗+卡铂+培美曲塞一线治疗后，本文患者PFS为8-9个月。不幸的是，由于癌症进展，患者死亡，我们无法评估患者接受二线靶向治疗后的PFS。最后，由于胸腔积液没有检出BRAF突变，我们假设患者可能患有双克隆疾病。此假设在临床上得到了验证，没有进行侵入性腹腔穿刺术，但达拉非尼+曲美替尼治疗快速控制了腹膜疾病。然而，该治疗未能阻止肺部和胸膜疾病的快速进展。我们推测BRAF和MEK抑制剂仅对II类BRAF外显子15 p.K601E突变部分有效。 BRAF突变是致癌驱动突变，根据作用机制分为三类。尽管BRAF和MEK抑制剂双重MAPK通路阻断治疗是BRAF外显子15 p.V600E突变肺癌的有效治疗策略，但在非典型BRAF突变中的潜在作用尚不明确。本病例表明BRAF外显子15 p.K601E突变可能导致疾病具有侵袭性，可能从达拉非尼联合曲美替尼治疗中获益。此外，化疗联合免疫治疗可作为一线治疗方案，特别是对于肿瘤负荷高的患者，可快速控制症状。 参考文献： De Felice, M.; Pisapia, P.; Pepe, F.; De Luca, C.; Iaccarino, A.; Malapelle, U.; Troncone, G.; Ianniello, G.P. Unusual Clinical Experience in BRAF Exon 15 p.K601E-Mutated Lung Cancer: A Case Report and Brief Review of the Literature. Appl. Sci. 2022, 12, 7552. https://doi.org/10.3390/ app12157552 病 例
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